繪制生長曲線的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
細(xì)胞受殺傷性藥物作用以后，可能出現(xiàn)多方面反應(yīng)，細(xì)胞的形態(tài)和增殖生長的變化是晟易于顯現(xiàn)的。檢測藥物對細(xì)胞增殖的影響情況可用于測試藥物效應(yīng)的研究。本節(jié)介紹的藥物對細(xì)胞增殖影響的實(shí)驗(yàn)主要包括繪制生長曲線的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、成集落的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、有絲分裂指數(shù)測定的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、縮時(shí)電影顯微攝像術(shù)的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。
一、繪制生長曲線的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
(一)試驗(yàn)原理
繪制培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線可計(jì)數(shù)細(xì)胞增長的數(shù)值，從而直觀地了解細(xì)胞生長與死亡的動態(tài)變化。常用于檢測藥物、培養(yǎng)液的成分和血清等對細(xì)胞生長的影響。
(二)材料
1．待檢材料(藥物)。
2．細(xì)胞培養(yǎng)成層的貼壁細(xì)胞。
3．試劑 0．25％溶液、O．02％EDTA溶液、培養(yǎng)基(RPMll640或DMEM)、小牛血清、Hanks液。
4．器材25ml培養(yǎng)瓶、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、微量加樣器、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、對數(shù)坐標(biāo)紙。
(三)買驗(yàn)方法
1.配制EDTA細(xì)胞分離液(消化液)，將0．25％溶液與等量目0．02%EDTA溶液混合而成。
2．將單層培養(yǎng)的細(xì)胞用細(xì)胞消化液進(jìn)行消化，使之成為lml的細(xì)胞懸液。
3.待檢藥物處理細(xì)胞將待檢藥物稀釋至合適作用濃度，向細(xì)胞懸液中加人一定量稍檢藥物作用8 h以上。
4.用Hanks液稀釋成10ml，取少量置血細(xì)胞計(jì)數(shù)板內(nèi)計(jì)數(shù)。將細(xì)胞懸液調(diào)節(jié)成(1～3)×105／ml，分別接種于25ml培養(yǎng)瓶中(根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要決定接種瓶數(shù)及每瓶接種的數(shù)量)。
5．每天每組取3瓶計(jì)數(shù)，計(jì)算均值，連續(xù)計(jì)數(shù)7d。
(四)結(jié)果與分析
用對數(shù)坐標(biāo)紙，以細(xì)胞濃度為縱坐標(biāo)，天數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制生長曲線。
(五)注意事項(xiàng)
1.用懸浮培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，除不用消化外，其余操作步驟均相同。但需離心收集細(xì)胞，再用Hanks液吹打成細(xì)胞懸液，然后計(jì)數(shù)。
2.在計(jì)數(shù)細(xì)胞期問，一般不更換培養(yǎng)液。若必須更換，實(shí)驗(yàn)組與對照組均同樣更換。
3．每天細(xì)胞計(jì)數(shù)均應(yīng)在相同時(shí)間進(jìn)行，以便減少實(shí)驗(yàn)誤差。
4.由于計(jì)數(shù)的誤差和細(xì)胞在操作過程中丟失或死亡等因素的影響，應(yīng)利用進(jìn)入生長狀態(tài)的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。除了進(jìn)行此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)外，一般應(yīng)再做分裂指數(shù)測定、成集落實(shí)驗(yàn)等，互相參考。
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